„Fortschritte der Medizin”

W. Meinhof: Izolacja i różnicowanie grzybów pato-gennych dla skóry - preparat bezpośredni. Fortschritte der Medizin 113. Jg., 1995, 32, 459-461.

Celem badania preparatu bezpośredniego przeprowadzonego przy użyciu techniki mikroskopowej jest stwierdzenie, czy i w jakiej ilości, w poddanym analizie materiale, znajdują się grzyby; ewentualnie uzyskanie wskazówek odnośnie rodzaju grzybów, wśród których najważniejszymi patogenami dla skóry są:
a) dermatofity - T. rubrum, T. mentagrophytes, T. verruco-sum, T. violaceum, T. equinum, M. canis, M. gypseum, E. floccosum;
b) grzyby drożdżakowe - Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. krusei, Cryptococ-cus neoformans, Pityrosporum orbiculare;
c) grzyby pleśniowe - Scopulariopsis brevicaulis, Aspergillus niger, A. candidus, Penicillium marneffei, Alternaria alternata.

Metody
1. Preparat natywny, nie barwiony: materiał (wymazy, osad moczu, kał) jest bezpośrednio lub po rozcieńczeniu wodą poddany badaniu pod mikroskopem (szkiełko podstawowe + nakrywkowe).
2. Preparat wodorotlenku potasu: struktury zrogowa-ciałe (złuszczający się naskórek, włosy, płytki paznokciowe) poddawane są działaniu ługu potasowego (10-30% roztwór wodny KOH) na szkiełku podstawowym. Po upływie 20-60 minut wyżej wymienione struktury stają się miękkie, przezroczyste i nadają się już do oceny mikroskopowej.
3. Barwiony preparat wodorotlenku potasu: do roztworu ługu potasowego zostaje dodany oporny na działanie ługu atrament do wiecznych piór - „Parker Superquink blue--black" - w małym stężeniu (1% lub mniej). Grzyby (i włókna celulozowe) barwią się na ciemnoniebiesko, podłoże zaś od bladoniebieskiego do bezbarwnego. Należy zaznaczyć, iż poza wyżej wymienionym, inne niebieskie atramenty do wiecznych piór nie nadają się do barwienia omawianego preparatu, gdyż ich barwnik zostaje zniszczony przez ług potasowy.
4. Inne metody barwienia: przy utrwalonych rozmazach niekiedy stosuje się metody barwienia wykorzystywane w bakteriologii (błękit metylenu, laktofenol - błękit bawełny, barwienie metodą Giemsy; PAS). Nie przedstawiają one jednak żadnych korzyści przy rozpoznawaniu grzybów.
5. Mikroskopia fluorescencyjna: barwniki fluorescencyjne (np. Calcofluor White, Uvitex 2B) są - z powodu zapewnienia wysokokontrastowych obrazów i ze względu na wyższą wydajność - zalecane w badaniu obecności grzybów w preparatach mikroskopowych bezpośrednich. Badanie to wymaga jednak poniesienia wyższych kosztów związanych z koniecznością zakupu mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki uzyskiwane badaniem mikroskopowym preparatu bezpośredniego
Najważniejszą informacją uzyskaną na podstawie badania preparatu bezpośredniego jest stwierdzenie, czy grzyby są obecne czy też nie. Obserwowane są one jako nici grzybni (hyphen) bądź jako okrągłe, pojedyncze komórki (zarodniki). Odróżnienie nitek grzybów od innych nitkowatych struktur (np. włókien tekstylnych lub roślinnych): hyphen są w większości rozgałęzione i podzielone; mogą się one rozpadać na tzw. artrospory.

Odróżnienie komórek okrągłych: komórki potomne ukazują się jako komórki siostrzane; silnie zarysowane ściany i struktury wewnętrzne są typowe dla komórek grzybiczych (np. w odróżnieniu od kropelek tłuszczu). Informacje na temat rodzaju znalezionych grzybów są zwykle niemożliwe do uzyskania, z wyjątkiem poniższych, dotyczących:
1. Malassezia furfur - charakteryzuje się typowymi, krótkimi nitkami grzybni (hyphen) i nagromadzeniem grubo-ściennych, okrągłych komórek, które są znamienne dla rozpoznania tego gatunku.
2. Dermatofitów - atakują grzyby na różne sposoby, które są charakterystyczne dla poszczególnych gatunków lub grup gatunków: wzrost typu „ectothrix" - często jako pochewka z zarodników naokoło włosa (M. canis) - lub „endothrix" - wzrost wewnątrz trzonu włosa (T. mentagrophytes).
3. Możliwości błędu - stwierdzenie jednoznacznych komórek potomnych wskazuje na grzyby drożdżakowe, nie jest jednak ich dowodem. Istnieją ponadto możliwości pomyłki z artrosporami.

Dychotomiczne rozgałęzienia są typowe dla grzybów rodzaju Aspergillus, jednak nie świadczą one bezwzględnie o ich rozpoznaniu.

Podobnie wahania kalibru hypen są typowe dla Zygo-myzeten (np. Mucor sp.), choć nie są dowodem ich obecności.

W. Meinhof: Izolacja i różnicowanie grzybów pa-togennych dla skóry - hodowla. Fortschritte der Medizin, 113. Jg., 1995, 33, 480-482.

Cele hodowli:
-Udowodnienie obecności grzybów (o ile nie udało się to badaniem mikroskopowym preparatu bezpośredniego).
-Określenie przynależności grupowej badanych grzybów (np. dermatofity, drożdżaki, grzyby pleśniowe); identyfikacja według gatunku i rodzaju.
-Uzyskanie hodowli wyjściowych do testowania wrażliwości na leki (np. przy leczeniu kandydozy 5-fluorocytozyną lub flukonazolem).

Metody
- Hodowla pierwotna: Stuży izolacji grzybów z materiału poddanego badaniu. Sabouraud-glukoze (2 lub 4%)-agar z dodatkiem przeciwbakteryjnego antybiotyku; dodatek Cyclohexamidu tłumi wzrost grzybów pleśniowych, hamuje także dermatofity (np. Epidermophyton floccosum).
- Tzw. pożywki selektywne: Powinny one ułatwiać izolowanie określonych gatunków grzybów lub ich grup, i tak np. podłoże Nickersona służy do izolacji drożdżaków (głównie Candida albicanś), zaś DTM do izolacji dermatofitów.
- Hodowle czyste: Uzyskiwane są przez odszczepianie od hodowli pierwotnych. Najczęściej używane podłoże wzrostowe to Sabouraud-glukoze-agar. Hodowle wyjściowe dla testowania wrażliwości, dla których konieczne są, w zależności od antymikotyku, podłoża specjalne (np. Difco Yeast Morphology Agar do testowania 5-fluorocytozyny).
- Pożywki specjalne do identyfikacji: Agar ryżowy do identyfikacji morfologicznej drożdżaków. Sabouraud-1/5-agar (Sabouraud-glukoze [tylko 0,4%]-agar [tylko 0,2%]) w celu bujniejszego tworzenia przez dermatofity konidii Difco Trichophyton-agar nr 1-7 w celu udowodnienia zapotrzebowania Trichophyton verrucosum, T. equinum, T. megninii na specjalne składniki w podłożach wzrostowych. Urea-agar do różnicowania T. rubrum od 7 men-tagrophyles.

Identyfikacja wyhodowanych kolonii grzybów
1. Makroskopowa - ocena wielkości, koloru i struktury powierzchni kolonii grzybiczych.
2. Mikroskopowa:
- dermatofity - struktura hyphen (np. spiralna u 7 men-tagrophytes, bambusowa, kandelabralna itd.; morfologia makro- i makrokonidii.
- drożdżaki (na agarze ryżowym) - blastospory, artro-spory, pseudomycelia, mycelia, chlamydospory.
- grzyby pleśniowe - liczne mikromorfologiczne cechy, jak np. łańcuchy z kolczastych zarodników w przypadku Scapulariopsis brevicaulis, struktury pędzla u Pe-nicillium sp., główki u Aspergillus sp., nieregularne, w rodzaju muru, podzielone konidia u Alternaria sp.
3. Metody różnicowania dermatofitów:
-test perforacji włosa (dla odróżnienia 7 rubrum od 7 mentagrophytes): po upływie 2-4 tygodni charakterystyczna perforacja włosa przez 7 mentagrophytes (nie obserwowana u 7 rubrum) - klinowate wtargnięcie prostopadle do osi włosa,
- test z mocznikiem (różnicowanie 7 rubrum z 7 mentagrophytes): T. mentagrophytes rozkłada mocznik i barwi w ciągu 1 tygodnia agar z mocznikiem na kolor czerwony (7 rubrum - nie)
- Difco Trichophyton - Agar 1-4: dowodzi zapotrzebowania na tiaminę i inositol w przypadku 7 verrucosum
- Difco Trichophyton - Agar 1 i 5: dowodzi zapotrzebowania na kwas nikotynowy w przypadku 7 equinum
- Difco Trichophyton - Agar 6 i 7: dowodzi zapotrzebowania na histidin w przypadku 7 megninii 4. Diagnostyka drożdżaków:
Niezależnie od identyfikacji morfologicznej Candida albicanś na agarze ryżowym, aby dokładniej określić inne gatunki i rodzaje drożdżaków, muszą zostać zastosowane metody biochemiczne:
a) badanie pod kątem wykorzystania źródeł:
-azotu, w szczególności nieorganicznego, w formie azotanu (tzw. asymilacja azotanowa),
-węglowodanów (tzw. asymilacja węglowodanów),
b) badanie zdolności fermentacji cukru.

Dostępne w handlu gotowe zestawy do badań ułatwiają współcześnie diagnostykę grzybów.