„Mycoses"

B. Willinger, A. Berger, L. Li, A.M. Hirschl, Ch. Aspóck, A. Makristathis, P.M. Priickl, M.L. Rotter: Epidemiologiczna analiza grzybów drożdżopodobnych przy pomocy elektroforezy pulsowej (PFGE). Mycoses, 1994, 37, (suppl. 1), 57-59.

Wraz z rozwojem metod molekulamo-biologicznych stanęły do dyspozycji naukowców nowe techniki pozwalające analizować DNA drobnoustrojów. Jedną z nich jest elektroforeza pulsowa (pulsed field gelelectophoresis -PFGE) stosowana dotąd z sukcesem w badaniu łańcuchów infekcji wywoływanych przez bakterie powodujące zakażenia wewnątrzszpitalne (np. oporne szczepy gronkowców, enterokoków). W PFGE wykorzystujemy DNA badanego drobnoustroju, który uzyskujemy poprzez lizę jego ściany komórkowej. Pierwotnie nie uszkodzony DNA zostaje pocięty przy użyciu enzymów restrykcyjnych na różnej wielkości fragmenty. Dzięki zastosowaniu zmiennego kierunku prądu uzyskuje się, w polu elektrycznym, wciąż nową orientację molekuł DNA, co umożliwia migrację także jego dużych fragmentów. Sumaryczny wektor zapewnia jednocześnie właściwą wędrówkę DNA - z góry na dół. Ta forma elektroforezy pozwala na rozdzielenie ww. molekuł DNA w zakresie od 0,1 do 20000 kilobasen (kb), dzięki czemu możliwa jest analiza całego genomu badanego drobnoustroju. Układ smug uzyskany po rozdzieleniu molekuł DNA metodą PFGE jest specyficzny dla danego szczepu. Przez porównanie układu smug różnych szczepów możemy stwierdzić, czy należą one do tego samego czy też różnych klonów.

Celem badań autorów artykułu było sprawdzenie, czy pomiędzy szczepami drożdżaków wyizolowanymi od matek i ich noworodków istnieją ewentualne różnice stwierdzalne przy użyciu omawianej wyżej - analizującej genotyp - metody. W ostatnich latach badaniami hodowlanymi stwierdzono przekazywanie noworodkom drożdżaków pochodzących z pochwy rodzącej w czasie porodu. Autorzy artykułu potwierdzili tę tezę przy użyciu nowej metody molekularno-biologicznej (PFGE).

Badaniami w kierunku drożdżaków objęto przebywające w dwóch wiedeńskich klinikach położniczych 103 położnice i ich noworodki. W tym celu w czasie trwającej akcji porodowej pobierano kobietom wydzielinę pochwową, zaś noworodkom wymazy z błony śluzowej jamy ustnej i odbytu w trzecim dniu po porodzie. Pobrany materiał inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C na podłożu Sabourauda (Oxid, Basingstoke, GB). Wyizolowane szczepy identyfikowano najpierw biochemicznie za pomocą Vitek-AMS-System (bioMerieux, Nur-tingen, Deutschland) i morfologicznie na podłożu ryżowym (BBL, Baltimore, Md, USA), następnie przeprowadzano analizę DNA-fingerprinting przy zastosowaniu PFGE (CHEF Mapper, BioRad, Hercules, CA, USA). U 39 kobiet (39,9%) stwierdzono drożdżaki w badanej wydzielinie pochwowej, przy czym w 94,9% należały one do Candida albicans, zaś w 5,1% do C. glabrata. Tylko u 6 noworodków udowodniono obecność drożdżaków w wymazie z jamy ustnej lub odbytu. Przy wykorzystaniu metody PFGE stwierdzono wyraźne różnice w układach smug pomiędzy C. albicans a C. glabrata. Szczepy C. albicans pochodzące od różnych kobiet wykazywały odmienności małego bądź średniego stopnia, zaś izolowane z wydzieliny pochwowej i z wymazu z pochwy jednej i tej samej kobiety były zawsze identyczne. Ten sam układ smug był również charakterystyczny dla szczepów drożdżaków izolowanych od matki i jej dziecka. Wyniki powyższe potwierdzają wspomnianą wyżej tezę, iż przeniesienie drożdżaków z matki na dziecko ma miejsce w pierwszej linii w czasie porodu.

O tym, czy metoda PFGE posiada wystarczające zdolności różnicowania szczepów różnego pochodzenia -zdaniem autorów artykułu - rozstrzygnąć powinny dalsze badania.

M. Ruhnke, I. Tennagen, E. Engelmann: Korelacja pomiędzy testami oporności a typowaniem szczepów Candida albicans izolowanych od pacjentów z AIDS i przewlekłą, nawracającą kandydozą jamy ustnej i gardła. Mycoses, 1994, 37 (suppl. 1), 60-63.

Kandydozą jamy ustnej i gardła, wywoływana przez grzyby Candida albicans, opisywana jest jako najczęstsza, oportunistyczna infekcja towarzysząca zespołowi nabytego upośledzenia odporności (AIDS). Leczenie jej środkami przeciwgrzybiczymi o miejscowym lub systemowym działaniu jest z reguły bardzo efektywne. Przybierające na sile upośledzenie obrony immunologicznej w przebiegu AIDS prowadzi do częstych nawrotów i konieczności powtarzania wymaganej terapii przeciwgrzybiczej. Doprowadza to do rozwoju oporności szczepów Candida albicans wobec stosowanych antymikotyków, głównie flukonazolu. Jest on bowiem lekiem z wyboru w terapii kandydozy jamy ustnej i gardła, charakteryzującym się dużą efektywnością, niewielkim działaniem ubocznym i rzadkim wchodzeniem w interakcje z innymi środkami farmakologicznymi. Rozwój oporności szczepów Candida albicans wobec flukonazolu stwierdzalny jest klinicznie i/lub badaniami in vitro (MIC).

Przy rozpatrywaniu przyczyn przewlekłej, nawracającej kandydozy jamy ustnej w przebiegu zakażenia wirusem HIV, obok pogłębiających się zaburzeń funkcji immunologicznych, bierze się pod uwagę także możliwość zastępowania saprofitycznego szczepu C. albicans przez szczep zjadliwy. Donoszą o tym Schmidt i wsp. Innego zdania jest Whelan i wsp. twierdząc, że u pacjentów chorych na AIDS nie występuje szczep o odmiennych właściwościach ani też o zwiększonej wirulencji. Zarówno Schmidt i wsp., jak i Whelan i wsp. w przeprowadzanych przez siebie pracach naukowych opierali się przede wszystkim na badaniach DNA drobnoustrojów przy użyciu techniki fingerpriting.

Istnieje dotąd bardzo niewiele doniesień mówiących o częstotliwości występowania danego sero- lub biotypu bąiź zmienności serotypowej (np. z A na B), względnie biotypowej szczepów C. albicans u pacjentów chorych na AIDS. Tym właśnie zagadnieniem zajęli się autorzy niniejszego artykułu. Systematycznie izolując szczepy C. albicans od chorych z zespołem nabytego upośledzenia odporności badali częstotliwość występowania określonych sero- lub biotypów oraz ich korelację z poziomem MIC, oznaczanym wobec flukonazolu. Od każdego z 65 pacjentów będących w objawowym stadium infekcji wirusem HIV (CDC B3/C3) i cierpiących na kandydozę jamy ustnej uzyskali w okresie około 30 miesięcy co najmniej 2 szczepy C. albicans (2-25 szczepów/1 pacjenta). Wszyscy ww. chorzy cechowali się zaawansowanym defektem immunologicznym (liczba limfocytów CD4 mniejsza od 75/ul). Od badanych pacjentów, będących przed i częściowo także po terapii przeciwgrzybiczej flukonazo-lem, wyizolowanych zostało z popłuczyn jamy ustnej (10 ml 0,9% NaCI) ogółem 169 szczepów C. albicans, które poddano: I. badaniu oporności wobec flukonazolu (MIC); II. biotypowaniu; III. serotypowaniu.

Ad. I. Wrażliwość szczepów C. albicans badana była przy użyciu metody microdilution (wg Troke i Pey, Pfizer Central Research). Uzyskane wyniki przedstawiały się następująco:
a) szczepy wrażliwe - 113/169. Wartości MIC kształtowały się w zakresie od 0,19 do 3,12 ug/ml;
b) szczepy średnio wrażliwe - 26/169. Wartości MIC - od 6,25 do 12,5 ug/ml;
c) szczepy oporne - 33/169, Wartości MIC równe i większe od 25 ug/ml.

Spośród 35 ww. szczepów opornych 26 pochodziło od 9 pacjentów, u których stwierdzono równolegle oporną klinicznie formę kandydozy jamy ustnej i gardła. Mianem oporności klinicznej definiowano przypadki braku odpowiedzi terapeutycznej na dawki dzienne flukonazolu sięgające wartości 300-400 mg. Pozostałe 7/33 oporne szczepy C. albicans pochodziły natomiast od 4 pacjentów, u których nie obserwowano oporności klinicznej wobec ww. leku.

Ad. II. Typ biologiczny określano przy użyciu 19 testów asymilacji węglowodanów, z których 11 pokrywa się z dotychczas stosowaną metodą wg Wiliamson pozwalającą na rozróżnienie 13 podstawowych biotypów C. albicans (B1-B13). Najczęściej występującym okazał się być biotyp B1 pojawiający się u 44,3% (N=75) badanych szczepów C. albicans. Wykazuje on zdolność asymilacji następujących węglowodanów: D-ksylozy, adonitu, ksyli-tu, sorbitu, -methly-D-glykosidu, N-acetyl-D-glucosaminy, sacharozy i trechalozy, nie asymiluje natomiast: L-ara-binozy, glycerolu i melezitazy. Kolejnymi co do częstości występowania były biotypy: B4 (32/169/; 18,9%) i B8 (24/169; 14,2%). Wszystkie inne biotypy były rzadsze i stanowiły ogółem mniej niż 5%, zaś te niemożliwe do ustalenia metodą Wiliamson i wsp. obejmowały 11,2% (11/169). Nie udało się autorom znaleźć korelacji pomiędzy określonymi biotypami a opornością szczepów C. albicans wobec flukonazolu.

Badaniami powyższymi potwierdzono jednocześnie tezę, iż biotypowanie przy zastosowaniu metody wg Wiliamson i wsp. prowadzi do otrzymywania bardzo zmiennych wyników. Podział na poszczególne biotypy - wg autorów artykułu - okazał się wyraźnie różny w porównaniu z pierwotnym opisem przeprowadzonym przez Wiliamson i wsp., w którym obok B1, dominował biotyp B2. Kortin i wsp. uzyskali przy zastosowaniu tej samej metody jeszcze inne wyniki.

Ad. III. Typ serologiczny ustalano przy zastosowaniu Candida Check Kit (Jatron Laboratories, Inc., Higashi--Kanda, Chiyoda-Ku, Tokio 101, Japan). Najczęstszym okazał się być serotyp A (150/169). Serotyp B stwierdzono tylko w 5 przypadkach. U pozostałych 14 szczepów C. albicans jednoznaczne określenie serotypu nie było możliwe przy użyciu ww. metody. Autorzy nie zaobserwowali żadnych zmian serotypu (np. z A na B) w powiązaniu z rozwojem oporności wobec flukonazolu.

Podsumowując należy stwierdzić, że u pacjentów chorych na AIDS, u których rozwinęła się klinicznie oporna na flukonazol forma kandydozy jamy ustnej i jednocześnie w badaniach in vitro wykazano wysokie wartości MIC (równe i większe od 25 mg/ml), nie stwierdzono żadnych zmian w biotypie lub serotypie mogących odpowiadać za przyczynę rozwoju oporności. Przedstawione badania pozwalają przypuszczać, że u badanych pacjentów z AIDS i nawracającą kandydozą jamy ustnej utrzymują się te same populacje Candida albicans, które jednak przy konieczności ciągłego powtarzania terapii flukonazolem stają się niekiedy oporne wobec ww. leku. Mechanizmy rozwoju oporności są- jak dotąd - nieznane. Jednoznaczne rozstrzygnięcia dotyczące stałości jednego i tego samego szczepu C. albicans powinny, zdaniem autorów, przynieść badania molekularno-biologiczne, z których obecnie stosowane są przede wszystkim: a) restriction fragment length polymorphism (RFLP), b) analiza kariotypu przy użyciu pulsed field gelectrophoresis (PFGE).

H. Freidank, L. Thiel, S. Henninger: Porównanie immunodyfuzji z immunoelektroforezą przeciwbieżną w wykrywaniu precypitujących przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom Candida i Aspergillus. Mycoses, 1994, 37 (suppl. 1), 79-83.

W ostatnich latach wyraźnie wzrosła liczba systemowych infekcji grzybiczych stanowiących poważne zagrożenie dla pacjentów z grup ryzyka (ze złośliwymi lub innymi ciężkimi chorobami podstawowymi). Duży problem przedstawia nadal wczesne rozpoznanie, a przede wszystkim rozgraniczenie pomiędzy ww. grzybicami a kolonizacją.

Trudności diagnostyczne wynikają m.in. z następujących przyczyn:
a) nie zostały dotąd ustalone jednoznaczne kryteria rozpoznawcze grzybicy systemowej,
b) u pacjentów z postawioną już diagnozą grzybicy posiewy krwi wypadają pozytywnie tylko w 25-82% przypadków,
c) przy samoograniczających się, przejściowych zakażeniach Candida mogą występować fałszywie dodatnie ich wyniki.

Celem jak najwcześniejszego uchwycenia grzybic układowych wprowadza się rutynowo - obok metod hodowlanych - testy serologiczne mające na celu wykrycie antygenów grzybiczych i ich przeciwciał. Przy użyciu metody immunofluorescencji (IFT) i hemaglutynacji (HAT) stwierdza się przeciwciała skierowane przeciwko ziar-nistościom ściany komórkowej. Znaczenie diagnostyczne ma zwłaszcza udowodnienie precypitujących przeciwciał skierowanych przeciwko wewnątrzkomórkowym antygenom proteinowym za pomocą immunodyfuzji lub immunoelektroforezy przeciwbieżnej. W tych przypadkach niekorzystny jest stosunkowo długi czas trwania do wystąpienia u pacjentów ww. przeciwciał.

Czułość metod służących do wykrywania antygenów Candida jest podawana (wg danych z piśmiennictwa) w dużym zakresie (od 31% do 90%), co wynika z różnorodności: po pierwsze używanych metod, po drugie populacji badanych pacjentów i wreszcie definicji grzybicy systemowej.

Powyższe parametry odgrywają również dużą rolę w ocenie metod serologicznych służących wykrywaniu przeciwciał Candida. W tym ostatnim przypadku podstawowe problemy diagnostyczne to: -wspomniane wyżej trudności w rozgraniczeniu miana przeciwciał związanego z kolonizacją od ich poziomu w przebiegu grzybicy systemowej, możliwości wystąpienia fałszywie negatywnych wyników u pacjentów z ciężkimi zaburzeniami odporności. Przy diagnozowaniu aspergillozy wyniki hodowli wypadają często fałszywie ujemnie. Wg danych z piśmiennic twa można ją rozpoznać na podstawie badania RTG w 78-100% przypadków. Z metod serologicznych w roz poznaniu aspergillozy (podobnie jak w przypadku Candida) za najbardziej niezawodne uważa się wykrywanie precypitujących przeciwciał. Daje ono następujący procent wyników pozytywnych:
- w przebiegu inwazyjnej, ostrej aspergillozy- od 70% do 80%,
- w przebiegu Aspergilloma - ponad 90%,
- w przebiegu alergicznej, oskrzelowo-płucnej aspergillozy - ok. 70%.

Autorzy przeprowadzili równoległe badania porównawcze metody immunodyfuzji z immunoelektroforezą przeciwbieżną celem ich oceny w wykrywaniu precypitujących przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom Candida sp. (103 surowice badane), względnie Aspergillus (100 surowic badanych). Porównywali, jak uzyskane wyniki korelują z innymi metodami serologicznymi - testem hemaglutynacji (HAT), i pośredniej immunofluorescencji (IFT). Do czasu realizacji powyższych badań porównawczych stosowali wyłącznie test immunodyfuzji, którego przeprowadzenie w laboratorium trwa przynajmniej 5 dni, a jest możliwe tylko 1 raz w tygodniu.

W przeciwieństwie do tego zastosowanie immunoelektroforezy przeciwbieżnej okazało się być metodą:
- szybszą (czas trwania tylko 2 dni),
- charakteryzującą się większą powtarzalnością (wiele razy w tygodniu).

Badania autorów wykazały ponadto, iż metoda immunoelektroforezy przeciwbieżnej jest:
- czulsza (była ona 2 x częściej pozytywna niż immunodyfuzja),
- wyniki jej korelują lepiej z silnie podwyższonymi mianami innych testów serologicznych (HAT, IFT).

Pomimo tego, iż wymaga ona zastosowania droższej aparatury w porównaniu z immunodyfuzja, za celowością jej stosowania przemawiają liczne ww. zalety.